Методы цитогенетических анализов

Кариотипирование с помощью дифференциального окрашивания

Центральной задачей при проведении цитогенетического анализа является определение кариотипа. Кариотипирование - это отправная точка всего исследования, определяющая возможность применения всех остальных методических подходов. Исследование набора хромосом в наиболее общей форме можно провести, используя различные методики рутинного окрашивания, при котором все хромосомы приобретают одинаковый цвет, равномерно распределенный по их длине. Такой метод позволяет определять количественные нарушения кариотипа, а также выявлять некоторые маркерные хромосомы без уточнения их происхождения. Поскольку такой подход мало информативен, основным методом анализа кариотипа остается техника G - дифференциального окрашивания хромосом (G - бэндинг) которую разработал в конце 1960-х годов Torbjorn Caspersson. В основе метода лежит приобретение хромосомами паттерна из светлых и темных полос по всей длине при обработке их трипсином с последующей окраской красителем Гимзы.

Характер исчерченности специфичен для каждой пары хромосом. Темные полосы (G - полосы, G - бэнды) образуются в местах локализации интерстициального гетерохроматина. Такие участки практически не содержат повторов ДНК и богаты А-Т-парами. В прометафазе, когда хромосомы находятся на ранней стадии конденсации, можно насчитать до 2000 полос, во вторых случаях - 400-800 полос Этот способ окрашивания позволяет идентифицировать хромосомы, выявлять делеции, инверсии, инсерции, транслокации, ломкие места и более сложные перестройки. Окрашиванию по G - методу предшествует предобработка цитогенетических препаратов. В зависимости от методики это может быть инкубация в буферах, не содержащих Ca2+ и Mg2+при t° <= 37°с или t° >= 60°с; инкубация в растворах протеолитических ферментов (трипсин, пепсин и др.); инкубация с депротеинизирующими веществами (мочевина, 2-меркаптоэтанол); инкубация в стандартном солевом растворе (SSC) под воздействием щелочи и высокой температуры.

Существуют различные методики G - дифференциального окрашивания хромосом, но обычно используется GTG (предобработка трипсином, окрашивание красителем Гимзы). Воздействие трипсина обеспечивает переход регулярной спиралевидной структуры в нерегулярную сегментацию, что препятствует восприятию красителя Гимзы в G - негативных участках и усиливает его в G - позитивных сегментах хромосом.

R - метод позволяет получить поперечную исчерченность хромосом, обратную таковой при G - окрашивании (т.е. темным G - полосам соответствуют светлые R - полосы и наоборот). Препараты, полученные при R - окрашивании, анализируют, используя фазово-контрастную микроскопию. При получении R - исчерченности хромосом для предобработки используют сбалансированный солевой раствор Эрла при t° = 78 - 96°С, а также определенных значениях рН и времени экспозиции, которые отличаются в различных методиках. Подготовка препаратов сложнее, чем при G - дифференциальном окрашивании, поскольку нередко используют предобработку Ва2 при 60°с или NаОН и формальдегидом.

Если проводит окрашивание по R - методу при более низких значениях рН растворов и с удлинением экспозиции, окрасятся только теломерные районы (Т - метод).

Q - дифференциальное окрашивание хромосом получают, используя флуорохромы, которые, возбуждаясь сине - фиолетовым светом, имитируют красное, желтое и оранжевое свечение. Из красителей обычно используют акрихин, но более качественные препараты получаются при окрашивании акрихин - ипритом или акрихин - пропилом; несколько хуже результат получают при использовании производного бибензимидазола Hoechst 33258. Сильно флуоресцирующие участки хромосом соответствуют темным G - дискам; отличие заключается в том, что вторичные перетяжки хромосом 1 и 16 окрашиваются только по G - методу, а интенсивность окрашивания сегментов хромосом 3, 4, 13 - 15, 21 - 22 и Y слабее при использовании Q - метода.

Если цитогенетический препарат поместить ненадолго в щелочь, а затем на длительное время оставить в растворе SSC при t° = 60 - 65°с, окрасится только структурный хроматин перицентромерных районов. Этот подход, получивший название С - метода используется для выявления перицентрических инверсий.

Появление новых технологий молекулярной цитогенетики, основанных преимущественно на in situ гибридизации нуклеиновых кислот, значительно расширило возможности хромосомной диагностики.
По материалам : Цитогенетические методы исследования хромосом человека: методические рекомендации / Под. ред. Т.Е. Зеровой - Любимовой, Н.Г. Горовенко. - К., 2003. - 25 с.

FISH метод (Fluorescence in situ Hybridization)

Метод FISH-анализа позволяет объективно выявлять индивидуальные хромосомы и их отдельные участки на метафазных пластинках (хромосомы в состоянии максимальной конденсации и визуализации) или интерфазных ядрах (деконденсированные хромосомы, без четкой морфологической структуры) на основе особенностей их молекулярно-генетического строения. Объектом исследования в данном случае являются особенности нуклеотидного состава конкретной хромосомы или ее отдельного участка.

Классический метод FISH-анализа основан на гибридизации известного по нуклеотидному составу ДНК-зонда с участком тестируемой хромосомы и с последующим выявлением результата гибридизации по метке – флуоресцентному сигналу в ожидаемом месте. Метод FISH-анализа превратился в необходимую аналитическую процедуру в ходе цитогенетического исследования и стал востребованным сегодня в пре- и постнатальной диагностике, в мониторинге зигот после искусственного оплодотворения, в процедуре предимплантационной генетической диагностики (ПГД) в ходе селекции эмбрионов с нормальным кариотипом и т.д.

Основные преимущества FISH-анализа:

• высокая разрешающая способность (на препаратах можно выявлять те хромосомные нарушения, которые не визуализируются в обычный световой микроскоп);
• точность диагностики (размер проб может варьировать от 90-100 тыс. до нескольких миллионов пар нуклеотидов, так что в качестве мишени могут быть не только отдельные гены или хромосомные участки, но и целая хромосома).

FISH-анализ позволяет выявить, к примеру, несколько аномальных клеток среди тысяч клеток с нормальным генотипом. Все эти преимущества очень важны в обследовании супружеских пар с проблемами репродукции, т.к. хромосомные изменения в такой группе пациентов, как правило, не имеют фенотипической клинической картины.