Цитогенетический анализ опухолей

Анализ хромосом

Описано большое количество хромосомных аберраций с прогностическим и терапевтическим значением. С одной стороны, базируясь на кариотипе, ОЛЛ разделяют на группы по плоидности, то есть в зависимости от количества хромосом (таблица 1), с другой - группируют по структурным аберрациям (таблица 2). Наиболее частая аберрация при ОЛЛ у взрослых – это t(9;22)(q34;q11), которая определяет очень неблагоприятный прогноз. Определение этой транслокации и ее молекулярно генетического продукта BCR-ABL очень важно в связи с применением в терапии ингибитора тирозинкиназы, иматиниба. Кроме того, определение транслокаций с использованием MLL-гена, который расположен на длинном плече хромосомы 11, прогностически значимо и требует специфических терапевтических подходов.

В случаях с t(8;14)(q24;q32), t(2;8)(p12;q24) или t(8;22)(q24;q11) происходит перестройка гена c-MYC. Эти случаи имеют шанс излечения при применении специальных терапевтических протоколов, которые отличаются от протоколов, которые применяются при других подтипах ОЛЛ.

Таблица 1- Частоты количественных аномалий в зависимости от плоидности при ГЛЛ у взрослых

Группы	Частота (%)
Нормальный кариотип	26-34
Гиподиплоидия <46	2-8
Псевдодиплоидия	7-59
Гипердиплоидия 47-50	7-17
Гипердиплоидия >50	4-9
Почти триплоид	3
Почти тетраплоид	2

Таблица 2 – Частота хромосомных аберраций при ОЛЛ у взрослых

Подтип ОЛЛ	Аберрация	Ген	Частота (%)
preВ	t(1;19)(q23;p13)	E2A-PBX1	3
proВ	t(4;11)(q21;q23)	AF4-MLL	6
Common	t(9;22)(q34;q11)	BCR-ABL	25-30
B	t(8;14)(q24;q32)	IGH-MYC	5
T	t(10;14)(q24;q11)	HOX11-TRC	3
preВ	t(12;21)(p13;q22)	ETV6-ALL1	<1
T, preВ	9p	P16INK4A	15
Common, preB, T	6q	?	6
T	14q11	TCR	6

Анализ хромосом

Описано более 50 структурных аберраций хромосом при ОМЛ. Кариотип лейкемических клеток является наиболее важным независимым прогностическим параметром при ОМЛ.

В 50 - 75% случаях ОМЛ у взрослых и в 75 - 85% - у детей определяются клональные хромосомные аберрации. Частота некоторых хромосомных аберраций зависит от возраста. Однако прогностическое значение кариотипа в большей мере не зависит от возраста.

Известно, что при ОМЛ разнообразные хромосомные аберрации определяют морфологические черты и клинический ход заболевания. В современной классификации ОМЛ (ВОЗ) цитогенетические аберрации используются как центральный критерий. Так, классификация впервые базируется на специфических цитогенетических транслокациях:

• ОМЛ с t(8;21)(q22;q22), AML1-ETO
• острая примиелоцитарная лейкемия (M/M3v) из t(15;17)(q22;q11-22) и ее варианты, PML-RARб
• ОМЛ с аномальной эозинофилией в костном мозге и inv(16)(p13q22) или t(16;16)(p13;q22), CBFв-MYH11
• ОМЛ с аномалиями 11q23 (MLL)

Базируясь на цитогенетике и патогенезе, ОМЛ можно разделить на три группы в соответствии с кариотипом:

1. ОМЛ с нормальным кариотипом (40-50%)
2. ОМЛ со сбалансированными аберрациями (20-25%), чаще всего t(8;21)(q22;q22), t(15;17)(q22;q11-22), inv(16)(p13q22), t(16;16)(p13;q22) и 11q23-перестройки с использованием гена MLL. Реже используются inv(3)(q21q26), t(6;9)(p23;q34) и t(3;21)(q26;q22).
3. ОМЛ с несбалансированным кариотипом (30-40%) включает трисомии (+8, +11, +13, +21), моносомии (-5, -7), делеции (5q-, 7q-, 9q-), а также большую группу со сложными аберрациями (3 и больше хромосомных аберраций, однако без сбалансированных аберраций).

По прогнозу ОМЛ разделяют на три группы, базируясь на кариотипе:

1. благоприятный: (8;21)(q22;q22), t(15;17)(q22;q11-22), inv(16)(p13q22), t(16;16)(p13;q22)
2. промежуточный: нормальный, все аномалии, не перечисленные в 1 и 3 группах
3. неблагоприятный: сложный аномальный кариотип -5/5q-, -7/7q-, 17p аберрации, 11q23/MLL – перестройки, inv(3)(q21q26), t(6;9)(p23;q34)

Для большинства редких аномалий прогностическое значение еще не определено. Значительная связь между генетическими аберрациями и ответом на терапию приводит к подходам, которые увеличивают селективную терапию в зависимости от кариотипа.

Прогностическое значение кариотипа важно для всех возрастных групп, как при ОМЛ de novo, так и при ОМЛ, которая возникла в результате терапии.

Анализ хромосом

Классический анализ хромосом играет незначительную роль в последние годы, в связи с трудностями в культивировании клеток in vitro. Прямое прогностическое значение хромосомных аберраций может продемонстрировать FISH-анализ. На сегодняшний день культивирование клеток при ХЛЛ позволяет определять более высокую частоту хромосомных аномалий по сравнению с FISH анализом.

Флуоресцентная гибридизация на стекле (FISH)

Цель FISH анализа – определение наиболее частых хромосомных аномалий при ХЛЛ, к которым относятся делеции 13q-, 11q-, 17p-, трисомия +12. Присутствие делеций 17р- или 11q- указывает на более агрессивный ход заболевания по сравнению с нормальным кариотипом, в то же время одиночная аномалия 13q подтверждает благоприятный прогноз. Кроме того, выявление t(11;14)(q13;q32) позволяет провести дифференцирование между ХЛЛ и лимфомой из мантийной зоны.

Анализ хромосом

У 90-95% пациентов с ХМЛ на цитогенетическом уровне определяется Филадельфийская транслокация: t(9;22)(q34;q11). Это транслокация между длинным плечом хромосомы 9 и длинным плечом хромосомы 22. У других пациентов определяется так называемая вариантная Филадельфийская транслокация или нормальный набор хромосом. Вариантные Филадельфийские транслокации разделяют на простые, в результате которых длинное плечо хромосомы 22 перемещается на другую хромосому (но не на хромосому 9), и сложные транслокации, в которые кроме хромосомы 9 и 22 вовлекаются другие хромосомы. Пациенты с ХМЛ и нормальным кариотипом имеют BCR-ABL перестройку, которая определяется с помощью FISH и ПЦР в реальном времени. При помощи FISH-метода, химерный ген BCR-ABL можно определить в хромосоме 22 или редко в хромосоме 9. Субмикроскопические вставки (инсерции) могут лежать в основе механизма, при котором не определяется классическая Филадельфийская хромосома. Эта группа называется «Филадельфия-негативная BCR-ABL-позитивная ХМЛ». Клинический и гематологический ход заболевания не отличается у пациентов с классической, вариантной Филадельфийской транслокацией и Филадельфия-негативной BCR-ABL-позитивной ХМЛ.

При прогрессии заболевания в фазу акселерации или в период бластного криза у 75-85% пациентов определяется дополнительный кариотип. Чаще всего появляются следующие аберрации (так называемая клональная эволюция): трисомия 8 (+8), изохромосома длинного плеча хромосомы 17 (и(17)(q10)), дополнительная Филадельфийская хромосома (der(22)t(9;22)(q34;q11)) и трисомия 19 (+19). Появление дополнительных аномалий кариотипа является прогностически неблагоприятным параметром и обуславливает клиническую демонстрацию бластного криза в течение 2-6 месяцев в большинстве случаев.

При ХМЛ прогностически очень важна оценка эффективности терапии для последующей коррекции лечения заболевания. Классический анализ хромосом является золотым стандартом в оценке цитогенетической ремиссии. Чтобы получить обоснованный результат, необходимо проанализировать не менее 20 метафаз. Полная цитогенетическая ремиссия (отсутствие Ph+ метафаз) отличается от «частичной» ремиссии (1-32% Ph+ метафаз), «малой» ремиссии (33-66% Ph+ метафаз) и от отсутствия ремиссии (≥67% Ph+ метафаз). Полная и частичная ремиссии составляют вместе понятие «наибольшая» ремиссия.

При терапии с применением иматиниба у некоторых пациентов определяется кариотипные аберрации в клонах без Филадельфийской транслокации. Чаще всего – это трисомия хромосомы 8. Следующей по частоте является моносомия хромосомы 7 и другие. Клиническое значение этого феномена до сих пор не выяснено и оценивается в клинических исследованиях.

Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH)

Используя FISH для выявления BCR-ABL перестройки в интерфазных ядрах, результат можно получить, как правило, в течение 24 часов. FISH-анализ имеет некоторые преимущества по сравнению с классическим анализом хромосом: использование этого метода при ХМЛ дает возможность диагностировать и мониторировать даже пациентов с Филадельфия-негативной BCR-ABL-позитивной ХМЛ. Кроме того, этот метод более чувствителен по сравнению с классическим анализом хромосом при выявлении минимального остаточного заболевания. FISH можно применять как на интерфазных ядрах, так и на метафазных хромосомах.

Обзор

Диагностика МДС базируется на цитоморфологическом анализе мазков костного мозга и периферической крови. Это исследование направлено на дифференциацию МДС и других клональных миелоидных заболеваний, таких как острая миелоидная лейкемия (ОМЛ) или ночная пароксизмальная гемоглобинурия, реактивные и другие доброкачественные состояния, которые характеризуются диспластическим гемопоэзом. Кроме цитоморфологии, существенную роль имеет цитогенетическое исследование, которое позволяет не только четко определить клональное заболевание в случае аберрантного кариотипа, но также помогает в классификации заболевания и оценке прогностического значения аномалии. Иммунофенотипирование позволяет идентифицировать экспрессию аберрантных антигенов, типичных для МДС и их значение возрастает для диагностики этого заболевания. В течение многих лет МДС-классификация базировалась только на цитоморфологии, согласно ФАБ классификации. Классификация ВОЗ, базируется как на ФАБ классификации с применением цитоморфологии, так и на цитогенетике и клинических параметрах.

Анализ хромосом

В контексте диагностической оценки МДС, хромосомный анализ играет значительную роль в определении кариотипных аберраций, типичных для МДС, особенно в сложных случаях во время цитоморфологической оценки. Типичные аберрации, которые рассматриваются для прогностической оценки, включают делецию Y хромосомы, del(5q), del(20q), также сложные аберрации и аберрации хромосомы 7. Когда возникают проблемы во время цитоморофологической дифференциации между МДС и ОМЛ в некоторых случаях может быть целесообразным цитогенетическое исследование. Выявление t(8;21)(q22;q22), t(15;17)(q22q11-12) inv(16)(p13q22)/t(16;16)(p13;q22) позволяет определить ОМЛ.

Благоприятный кариотип: нормальный, - Y, del (5q), del (20q).
Неблагоприятный кариотип: сложная аномалия (µ3 аберраций), аберрации на хромосоме 7.

Обзор

Диагностика МПЗ базируется на совместном использовании методов цитоморфологии, анализа хромосом, FISH и молекулярной генетики.

Цитоморфология включает цитохимию и окрашивание железом, как составную часть стандартной диагностики МПЗ. Это необходимо для выделения разных типов миелопролиферативных заболеваний.

Классический анализ хромосом позволяет определить аберрантный кариотип, который часто встречается при МПЗ. Он включает как количественные аберрации, такие как трисомия хромосом +8 и +9, так и сбалансированные перестройки, которые приводят к слиянию генов на молекулярном уровне. В большинство этих перестроек вовлекаются гены, которые кодируют тирозинкиназы, но они встречаются редко. Вовлечение киназ важно не только для диагностики заболевания, но и для терапии, в связи с чувствительностью аномальных клеток к терапии ингибиторами тирозинкиназ.

FISH анализ используют для решения специфических задач в диагностике МПЗ. Для решения задач, как диагностики, так и терапии, с целью исключения BCR-ABL-перестройки и таким образом ХМЛ. Кроме того, некоторые другие перестройки тирозинкиназ можно обнаружить методом FISH.

Молекулярная генетика важна для разработки диагностики МПЗ для исключения BCR-ABL-перестройки и выявления другого сливного транскрипта, из которых наиболее важными являются мутации гена JAK2. V617F-мутация гена JAK2 присутствует у 90% пациентов с полицитемией Вера, в 30% - с эссенциальной тромбоцитемией и хроническим идиопатическим миелофиброзом.

Анализ хромосом

Хромосомные аберрации определяются у 35% пациентов с полицитемией Вера и у 40% с хроническим идиопатическим миелофиброзом. У пациентов с эссенциальной тромбоцитемией аберрации кариотипа наблюдаются очень редко.

Полицитемия Вера (ПВ)

Чаще всего при ПВ определяется делеция длинного плеча хромосомы del(20q). Кроме того, часто наблюдаются трисомии хромосом +8 и +9. Изредка определяются делеции длинного плеча хромосомы del(13q) и дополнительного материала на длинном плече хромосомы add(1q). Частота хромосомных аберраций увеличивается в ходе заболевания. Трансформация в МДС или ОМЛ также связана с частотой аберраций кариотипа. Присутствие хромосомных аберраций во всех случаях связано с неблагоприятным прогнозом.

Хронический идиопатический миелофиброз (ХИМ)

У пациентов с ХИМ чаще всего определяется делеция (потеря) материала длинного плеча хромосомы del20 и del13 (по 6-7%, соответственно). Кроме того, описаны как количественные аномалии хромосом 7, 8 и 9, так и структурные аберрации длинного плеча 1q и 5q.

Эссенциальная тромбоцитемия (ЭТ)

Только приблизительно 5% пациентов с ЭТ несут клональные аберрации кариотипа, у них чаще всего наблюдается трисомия хромосомы +9.

Делеция длинного плеча хромосомы del(20q), трисомия хромосом +8 и +9, делеция длинного плеча хромосомы del(13q), и дополнительный материал на длинном плече хромосомы add(1q) являются самыми частыми аномалиями кариотипа при так называемых «других» миелопролиферативных синдромах.

Специфический миелопролиферативный синдром, так называемый 8р11-синдром характеризуется специфическими сбалансированными транслокациями с вовлечением диска 8р11. Для таких пациентов характерны лимфаденопатия и постоянная усталость. Костный мозг и периферическая кровь имеют черты миелопролиферативной неоплазии, включая эозинофилию. Параллельно часто присутствует периферическая Т-клеточная лимфома, изредка - острая лимфобластная лейкемия В-клеточных предшественников. В большинстве случаев эти миелопролиферативные неоплазии прогрессируют в острую миелоидную лейкемию с очень неблагоприятным прогнозом. На цитогенетическом уровне часто наблюдается транслокация t(8;13)(p11;q12). Молекулярное клонирование этой транслокации позволяет обнаружить слияние гена FGFR1 на 8p11, который кодирует рецепторы фактора роста фибробластов. Транслокация ведет к существенной активации домена тирозинкиназы.

Выполнение классического анализа хромосом при ММ представляет сложность в связи с низкой пролиферативной активностью клеток. Важную роль играет FISH анализ в интерфазных ядрах. Использование хромосом-специфических центромерных зондов или локус-специфических зондов хромосомных аберраций позволяет обнаружить аберрации в 88-97% случаях. Наиболее часто в перестройках встречаются трисомии хромосом +3, +7, +9, +11 и +15 и моносомии хромосом -1, -13 и -22. Перестройки тяжелой цепи иммуноглобулина (IGH) с разными генами-партнерами также часто наблюдаются при ММ. Чаще всего это гены-партнеры CCND1 (11q13), FGFR3 (4p16) и MAF (16q23). В соответствии с опубликованными данными, t(11;14)(q13;q32) имеет благоприятный прогноз, тогда как t(14;14)(p16.3;q32) t(14;16)(q32;q23) обуславливают неблагоприятный прогноз. В выборке из 102 пациентов параллельно проводили анализ хромосом и FISH. Было подтверждено, что делеция del(13q), которая определяется хромосомным анализом, представляет неблагоприятный прогноз. Однако, делеция del(13q) была обнаружена у большинства пациентов с использованием FISH-анализа. Пациенты с del(13q), установленной при FISH-анализе, но без хромосомного анализа, не имели неблагоприятный прогноз. В другом докладе, однако, было показано, что del(13q), которую определяли методом FISH, имеет очень неблагоприятный прогноз.